摘要：轮状病毒(du)(du)感染(ran)性腹泻是婴幼儿急诊和死(si)亡（除呼吸道感染(ran)之外）的(de)第(di)二(er)位病因，目(mu)前尚无有效(xiao)的(de)治疗药物。而轮状病毒(du)(du)疫苗(miao)是预防轮状病毒(du)(du)感染(ran)最经济有效(xiao)的(de)手段(duan)。在(zai)疫苗(miao)的(de)质量控制中，外源因子是重(zhong)要的(de)检(jian)测指(zhi)标。在(zai)2010年(nian)，葛(ge)兰素(su)史(shi)克和默克世界两大疫苗生(sheng)产厂商所生(sheng)产的 Rotarix^R和(he)RotaTeq^R中，均检出有外源因子(zi)——猪圆(yuan)环病毒(PCV)。这是(shi)继(ji)肠(chang)套叠事(shi)件之后(hou)，轮状病毒疫苗的(de)(de)安全性问题再(zai)度(du)成(cheng)为(wei)卫生(sheng)领域关(guan)注的(de)(de)焦点(dian)。本次事(shi)件中所产生(sheng)的(de)(de)焦点(dian)问题包括(kuo) PCV  DNA 的来源(yuan)、PCV 对人类是(shi)否致病、疫(yi)苗中是(shi)否存在完整的(de) PCV  DNA序列和病(bing)毒样颗粒、口服疫苗后能否造成人类的感(gan)染等(deng)安全性(xing)问题(ti)。GSK公(gong)司推测其来(lai)自于细(xi)胞(bao)传代所(suo)用(yong)的猪源性的胰酶。在疫苗细(xi)胞(bao)基质制备中胰酶是常用(yong)的原料，这(zhei)对(dui)采用(yong)细(xi)胞(bao)基质生产的疫苗的安全问题带(dai)来(lai)了(le)更多的困惑(huo)，同时，公(gong)认的检测方(fang)法和标准品需要继(ji)续完善。

近十年来，国内、欧洲、印度的重组胰岛素、疫(yi)苗研发和生产(chan)、干(gan)细胞(bao)培养企(qi)业都相继开始换用重组胰蛋白酶，我(wo)国药典委(wei)员(yuan)会也委(wei)托上(shang)海雅(ya)心生物技术有限公司开展(zhan)2020年版《中(zhong)(zhong)国药典》中(zhong)(zhong)重组(zu)胰蛋白酶标准的制(zhi)定工作(zuo)，上海雅心是2020版重(zhong)组(zu)胰(yi)(yi)蛋(dan)白酶(mei)药典标准制定的(de)承办单(dan)位，也(ye)是国(guo)家重(zhong)组(zu)胰(yi)(yi)蛋(dan)白酶(mei)标准品的(de)提供单(dan)位。重(zhong)组(zu)猪胰(yi)(yi)蛋(dan)白酶(mei)是由重(zhong)组(zu)大肠杆菌表达生(sheng)产，氨(an)基酸序(xu)列与猪胰(yi)(yi)腺来源(yuan)(yuan)的(de)胰(yi)(yi)蛋(dan)白酶(mei)完全一致，具有与动物(wu)源(yuan)(yuan)性猪胰(yi)(yi)蛋(dan)白酶(mei)相同(tong)的(de)酶(mei)学性质，可替代猪胰(yi)(yi)腺来源(yuan)(yuan)胰(yi)(yi)蛋(dan)白酶(mei)应(ying)用于各种(zhong)生(sheng)物(wu)技术过(guo)程中。

 

 

2010 年 3 月(yue)，Victoria 等利用宏(hong)基因(yin)组学(xue)和微生(sheng)物基因(yin)组学(xue)技术，对(dui)包(bao)括口(kou)服脊(ji)髓灰质炎疫苗、 风疹病(bing)毒(du)(du)疫苗、麻疹病(bing)毒(du)(du)疫苗、黄热病(bing)病(bing)毒(du)(du)疫苗、水痘(dou)病(bing)毒(du)(du)疫苗、2种(zhong)轮状病毒疫苗及(ji)麻疹风(feng)疹流行性腮(sai)腺炎联合疫苗在内的8种减毒活(huo)疫苗的检测中(zhong)发(fa)现，在葛兰(lan)素史克(ke)公司(si)（GSK）生产(chan)的轮状病毒 （Rotavirus，RV）疫苗 Rotarix 中(zhong)存(cun)在 1 型猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）的DNA片段。与此同时，FDA 于 2010年(nian)3月(yue)22日发布消息称在(zai)Rotarix中检出了外源性病毒成(cheng)分，因此，建议暂(zan)时停(ting)止(zhi)使用(yong)该疫苗。

 

 1.轮状病毒疫苗及猪圆环病毒

 

现(xian)在全球已经批准上市的轮状(zhuang)病毒疫苗包(bao)括(kuo)葛(ge)兰素史(shi)克（GSK）的 Rotarix、默克(ke) （Merck）的(de) RotaTeq，兰州生物(wu)制品研究所(suo)有限责任公司(si)生产的口服轮(lun)状病毒减毒活疫苗（Lanzhou lamb rotavirus vaccine，LLR）仅在中国使用。3种(zhong)轮状病毒疫苗的销售量大，使用的地(di)区范围广，因此，该疫苗污染存在广泛的社(she)会影(ying)响和安全隐患。

 

PCV 是(shi)一种无包膜的单链环状 DNA 病毒，呈正二十面体，直(zhi)径约(yue) 20 nm，基因组大小约(yue)为1760 nt，包括两个主(zhu)要(yao)的开放读码框（ORF）。PCV最早被发现于传代猪肾(shen)细胞（PK-15）。PCV 分为 PCV1 和 PCV2 两型，具有致(zhi)病性的PCV2与目(mu)前认为无致病性(xing)的 PCV1的基因同源性仅为 76%，但基(ji)因(yin)组结(jie)构非常(chang)相似。包括人、鼠、牛、猪等多(duo)种(zhong)哺乳动(dong)物体(ti)内均(jun)能检测到 PCV 抗(kang)体，但PCV对这(zhei)些动(dong)物的致(zhi)病性尚(shang)未确(que)定。

 

 2. PCV 的检测及(ji)应对原则

 

美国 FDA 采(cai)取积极措施(shi)应对(dui)该(gai)突发事件。在暂停使用 Rotarix 之后，建议(yi)美国 Merck 公司(si)筛查其(qi)生产的轮状病毒疫苗 RotaTeq，初步结果显(xian)示，RotaTeq 中存在猪圆环病毒 1 型和2型的 DNA片段（疫苗液经20 倍浓缩后检出，原(yuan)液(ye)中 PCV 的DNA片段(duan)单位含量接近检测限），该(gai)结(jie)果也得到了FDA 的证实。在(zai)收集了(le)更多的信(xin)息(xi)并进行了(le)内部实验之后，2010 年 5 月 7 日(ri)，FDA 与疫苗及相关生物制品咨询委员会（Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee）召开会议，共同研讨此次污染事件。会议介绍了 PCV 意外检出的背景情况，认为现在尚无证据证明 PCV 对人类具有致病性，并讨论了 PCV 的存在对Rotarix和RotaTeq 的使用造成的风险和应对的措施。此次(ci) PCV1 的(de)检出（不止是针(zhen)对 PCV1）也(ye)提示现有的(de)传统检测(ce)技术(shu)已不能(neng)满足生(sheng)物制品检测(ce)的(de)需要。对于人用病毒疫苗生产中所用的细胞介质、 病毒毒种和其他生物原料的分析检测，现已有一些尚未应用的高级分析检测方法，会议也对这些方法的实际应用提出了建议。2010 年 5 月 14 日，FDA 更 新了该事件的后续报道，将“暂停使用 Rotarix”的建议修改为“建议临床重新使用 Rotarix，继续使用 RotaTeq”。修改的依据有三点：

① GSK 和(he) Merck两(liang)公司均有良好的安全记录(lu)，并进行过(guo)大量的临床(chuang)试验；

②尚无证据表明 PCV 可对(dui)人类安(an)全(quan)造成危害；

③使用轮状病毒疫(yi)苗带来的益(yi)处远高(gao)于(yu)PCV 存在造成理论上(shang)潜(qian)在的危害。

 

FDA 和(he)(he)厂商(shang)将继(ji)续深入调查(cha)并评价(jia)各方检(jian)(jian)测结(jie)果。 在中国(guo)，中国(guo)食品(pin)药品(pin)检(jian)(jian)定研究(jiu)院（National Institutes for Food and Drug Control，NIFDC）获悉此次(ci)事件后(hou)，及时建立和(he)(he)完善了 PCV 检(jian)(jian)测技术(shu)，对注(zhu)册(ce)检(jian)(jian)定留样的 2 批 Rotarix 和(he)(he) RotaTeq 进行了检(jian)(jian)测，也证明了 Rotarix 中 PCV1  DNA 的存在。应(ying) WHO邀 请，NIFDC 专(zhuan)(zhuan)家(jia)于(yu) 2011 年 5 月 18 日，赴(fu)美(mei)国(guo)马里兰州巴尔(er)的摩参(can)加了 WHO 关(guan)(guan)于(yu)生(sheng)物制品(pin)中发现外源因(yin)(yin)子污染后(hou)的风险评估指导原则（草案）修订专(zhuan)(zhuan)家(jia)会，并作了题(ti)为《我国(guo)生(sheng)物制品(pin)中外源因(yin)(yin)子检(jian)(jian)测与控(kong)制现状》的专(zhuan)(zhuan)题(ti)报告。随后(hou)于(yu) 5 月 19 日至 5 月 21 日，应(ying)邀参(can)加了国(guo)际生(sheng)物制品(pin)标准(zhun)化协会（International Alliance for Biological Standardization，IABS）召开的关(guan)(guan)于(yu)外源因(yin)(yin)子检(jian)(jian)测新(xin)技术(shu)和(he)(he)风险评估的学(xue)术(shu)研讨会。

 

 3.重组胰蛋白酶替代动物源性胰蛋白酶用于生物制药中

 

近十年来，国(guo)内、欧洲、印度的重组(zu)胰岛(dao)素、疫苗(miao)研发和生产、干(gan)细胞(bao)培养企业都相(xiang)继开(kai)始换(huan)用重组(zu)胰蛋白(bai)酶，我国(guo)药典委员(yuan)会也(ye)委托上(shang)海雅心(xin)生物技术有限公司开(kai)展(zhan)2020年(nian)版《中国药典》中重组胰蛋白酶标准(zhun)的制(zhi)定工(gong)作，上海(hai)雅心(xin)是(shi)2020版重(zhong)(zhong)组(zu)(zu)(zu)胰蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)药典标(biao)准制定(ding)的承办单位(wei)，也是国家重(zhong)(zhong)组(zu)(zu)(zu)胰蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)标(biao)准品的提供单位(wei)。重(zhong)(zhong)组(zu)(zu)(zu)猪(zhu)(zhu)胰蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)是由重(zhong)(zhong)组(zu)(zu)(zu)大肠杆菌表达生(sheng)产，氨(an)基(ji)酸序列与(yu)猪(zhu)(zhu)胰腺(xian)来(lai)源的胰蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)完全一致(zhi)，具有与(yu)动物(wu)(wu)源性猪(zhu)(zhu)胰蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)相同的酶(mei)(mei)学性质(zhi)，可替代猪(zhu)(zhu)胰腺(xian)来(lai)源胰蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)应用(yong)于各种生(sheng)物(wu)(wu)技术过(guo)程中。